现代电子显微镜技术在病毒检测中的应用进展

电子显微镜技术(Electron—microscopy，EM)已经有近100 年历史，适应其不同功能需要逐步发展形成透射电镜和扫描电镜技术，分别用于样品内部结构及自然形貌的分析。电镜的分辨率不断提高，目标是超微检测、动态观察和分析计算有机结合。病毒是目前所知结构最为简单的生命单位，具有特定超微结构特征，但是病毒具有复杂的变异及进化过程。在19 世纪末，人们就已经发现存在比细菌还小的生物有机体，但是真正观察到病毒还是在电镜技术发展成熟后。因此电镜技术是推进病毒学发展的重要手段。

1 电镜技术检测病毒的优势

电镜技术检测病毒的主要优点在于无需特异性生物试剂可直接观察，而分子生物学、血清学检测方法则需要特异性探针发现病毒。一般情况下，新发疾病的致病因素很难确定，但是运用电镜技术可直接观察病原体，如病毒。然而分子生物学检测手段需提前获取检测对象的生物特异性。虽然电镜技术只能观察到病毒表征不能确定种属，但其观察数据给其他更具特异性的生物学检测手段指明了目标。如果病毒的体外培养模型尚未建立，生物学方法研究病毒就显得非常困难。此时电镜就显得格外重要，即使当今分子生物学诊断检测技术迅猛发展，也需先通过电镜技术来检测一些新的、非常规的病毒为其做进一步研究铺垫。电镜还可以用来研究病毒附着、复制的分子机制，其研究结果有助于开发抗病毒药物和疫苗。

2 电镜技术病毒发现史

Ernst Ruska 和Max Knoll 发明了电镜，随后Ruska、Kausche 和Pflankuch 首次用电镜观察到病毒。1952 年，电镜技术首次揭开了脊髓灰质炎病毒的面纱。20 世纪50 年代中期，采用电镜技术开始进行对病毒与宿主细胞关系的研究。而早期的病毒学分类主要就是依靠电镜观察结果。通过采集粪便标本，用负染色技术，用电镜还发现了许多肠道病毒。电镜技术的运用成功发现了1976 年大暴发的埃博拉病毒。1999 年，运用电镜技术发现了可以引起皮肤异常病变、免疫抑制的病毒-多瘤病毒。此外，最为著名的是用电镜技术发现了SARS 的致病因子-冠状病毒[1]。使用电镜观察病毒并不要求病毒的完整性或致病性，因此成功鉴定出天花病毒。另外，由于电镜技术检测速度快，不少国家的CDC 部门常用其监测生物（病毒）武器[2]。目前，用来快速检测新发病毒的电镜技术已经越来越成熟和规范。

3 病毒检测的电镜技术

3.1 负染色技术

负染技术 (Negative staining) 是透射电镜观察病毒形态的核心技术之一,其应用很大地促进了病毒形态学和病毒电镜检测的发展[3]。对于病毒样品的检测，需要在铜网上放置一支持膜才能保留这些小颗粒病毒。常用的膜剂有：Formvar,Collodion,Butvar,和Pioloform[4]。这些膜剂可形成超薄膜且具有导电性，在电子束照射下不会融化。现已有商品化的铺好膜的铜网，但由于膜的有效保存时间很短，因此，其成品铜网商品化受到一定限制。由于要保证样品在膜上的平整性，这些膜还必须是具有亲水性的。

常用的负染剂有uranyl acetate 和 phosphotungstic acid (PTA)。Uranyl acetate 既是固定剂也是染色剂，可观察到病毒完整形态和颗粒表面，但该试剂在磷酸盐存在下会发生沉淀且具有放射性。PTA 不具有放射性，在磷酸盐下不会沉淀，可观察到有包膜病毒表面刺突，但在几个小时后会降解病毒[4]。

为了提高病毒负染样本检测敏感度，可以采用提高样本内病毒浓度的方法和提高载网吸附病毒能力的方法这两种方法，而提高样本内病毒浓度的方法包括超速离心法、琼脂过滤法、冻干法、超滤法、沉淀法、离子交换捕获法、假复型法、免疫负染法，提高载网吸附病毒能力的方法包括辉光放电、紫外线照射、多聚赖氨酸 (Poly2L2lysine) 增强吸附法、增加载网表面亲水性的试剂等方法[5]。

3.2 超薄切片技术

由于组织标本太厚，电子束不能全部穿透，因此就需要使用超薄切片技术对组织标本进行预处理。常规用于组织的超薄切片技术也适用于病毒检测。制作超薄切片的过程主要有固定、漂洗、脱水、浸透、环氧树脂包埋、超薄切片。超薄切片应用于病毒检测的主要缺点在于，如果病毒仅存在样品局部，那么切片时很可能得不到含有病毒的切片[6]。对于体外细胞培养下的病毒研究，电镜观察病毒时，可将这些细胞做离心处理，再对沉淀物用戊二醛固定，使它们聚集成团块，再做后续的常规切片处理。

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